单细胞转录组（scRNA-seq）典型实验流程
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单细胞分离自组织样本获取单个细胞（显微切割、流式分选、微流控/液滴平台等）。
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细胞裂解在保护细胞内 mRNA 的条件下进行裂解。
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mRNA 捕获用 poly(T) 引物结合 mRNA 的 poly(A) 尾实现分子捕获。
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反转录将 mRNA 逆转录为 cDNA（poly(T) 引物起始）。
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cDNA 扩增PCR 或体外转录（IVT）放大低起始量的 cDNA。
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文库构建与加索引制备测序文库并加入样本条形码（index）。
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文库混合多样本文库混合上机，提升测序通量与性价比。
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高通量测序采用 NGS 平台获取转录本序列读段。
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生信分析质控、去噪、归一化与降维（如 t-SNE/UMAP），聚类与注释，差异分析与通路解析等。
随着高通量测序技术的进步，单细胞转录组分析（scRNA-seq）为研究者提供了在单细胞分辨率下测量基因表达的能力， 有助于揭示细胞群体中的异质性、发育轨迹以及功能状态变化。
与传统的群体测序相比，单细胞转录组能够捕捉稀有细胞类型，解析细胞间的差异与联系， 在肿瘤免疫、组织发育、疾病机制研究等领域展现出巨大潜力。
我们将系统梳理单细胞转录组的分析流程，从数据采集、质控、降维聚类到功能解读， 帮助科研人员高效、精准地解析单细胞层面的分子信息。
数据准备与质量控制
目标：去掉低质量/双细胞，获得稳定可靠的表达矩阵。
关键检查：
● 细胞基因数 ● UMI ● 线粒体/核糖体比例 ● 双细胞检测（Doublets）
常用方法：
FastQC、CellRanger / STARsolo、Scrublet / DoubletFinder、阈值过滤
产出：
高质量的细胞×基因表达矩阵（count matrix）、质控报告与过滤参数记录
降维、聚类与细胞类型注释
目标：获得可解释的细胞群及其功能/空间含义，并为后续分析提供稳定标签。
降维：
● PCA（线性主成分，输入后续步骤） ● UMAP/t-SNE（非线性可视化，呈现簇结构） ● 变量特征选择（HVGs）与尺度化（Scale）
聚类：
● 图谱聚类：Louvain / Leiden（基于KNN图） ● 分辨率调优（resolution grid search） ● 过/欠聚类检查与合并（marker一致性、轮廓系数）
细胞类型注释：
● Marker基因规则库（CD3D、MS4A1、LYZ、COL1A1 等） ● 参考库：SingleR、CellTypist、scHCL ● 专家修订与亚群拆分（子簇marker复核）
与空间数据衔接（可选）：
● 以注释簇为来源，映射到空间数据（如 Tangram / Cell2location）
产出：
低维坐标（PCA/UMAP/t-SNE）、聚类标签（簇ID）、细胞类型注释表、关键marker清单与可视化图件。
差异表达与功能富集
目标：找出关键标志物和核心通路，支持分型与机制推断。
差异表达（DE）：
● 统计方法：Wilcoxon、MAST、edgeR / DESeq2（伪 bulk） ● 分组策略：簇间、条件间、时间点比较 ● 输出指标：log2FC、p 值、调整后 p 值（FDR）
功能富集：
● 数据库：GO、KEGG、Reactome、WikiPathways ● 方法：GSEA、GSVA、ORA（Over Representation Analysis） ● 结果呈现：条形图、气泡图、网络图
产出：
差异基因列表（带统计指标）、通路富集结果表、可视化图件（火山图、气泡图、网络图）及对应脚本。
拟时序与谱系轨迹
目标：解析细胞状态随时间或分化过程的动态变化及分支关系。
方法：
● Monocle3（基于学习图构建拟时序） ● Slingshot（整合聚类与轨迹推断） ● PAGA（图抽象简化轨迹结构） ● Palantir（概率式轨迹与终末状态预测）
输出：
● 拟时序坐标与轨迹图 ● 分支节点与分化路径 ● 动态基因模块（随时间变化的表达模式）
应用：
发育与分化过程研究、耐药演化机制解析、免疫活化与衰竭路径分析。
细胞—细胞通讯
目标：解析配体-受体信号轴与网络结构，揭示细胞互作及微环境重塑机制。
方法：
● CellChat（全局通信概率与主导通路识别）
● CellPhoneDB（配体-受体配对统计与显著性检验）
● NicheNet（配体驱动的下游基因预测）
● LIANA（多工具整合评估，统一评分框架）
输出：
● 配体-受体网络与强度矩阵（群体/簇间通信图）
● 关键信号轴：如 TGF‑β、CXCL/CCR、EGFR、IFN 等
● 受体端下游靶基因与受影响通路（可视化：弦图、热图、气泡图）
应用：
肿瘤-免疫互作解析、免疫逃逸与炎症放大环识别、微环境重塑与治疗靶点筛选、疗效/耐药相关通信模式比较。
批次效应与多组学整合
目标：消除技术/样本来源差异，统一坐标系；融合多模态信息提升解析深度与稳定性。
批次校正：
● Harmony（嵌入对齐，速度快、稳健）
● MNN / FastMNN（互为最近邻匹配，减少批次偏移）
● BBKNN（图构建层面的批次平衡）
● Seurat Anchors / Scanorama（锚点配准，跨平台整合）
多组学整合：
● scRNA + ATAC：Seurat v4 WNN / ArchR（转录 × 染色质可及性共解析）
● 蛋白（CITE‑seq）：ADT 与 RNA 表达联合建模（WNN/TotalVI）
● 甲基化/空间：Tangram、Cell2location（将单细胞注释映射到空间坐标）
● 代谢/配体‑受体：与代谢通路/通讯网络耦合，形成多层证据链
质量评估与可视化：
● 批次标签在 UMAP/TSNE 上的混合度（kBET、LISI 指标）
● 保真度：已知生物亚群的聚类纯度与marker一致性
产出：
统一整合后的低维嵌入与邻接图、跨批次聚类标签、多组学联合注释表与关联图件（WNN热图、共嵌入UMAP、对齐前后对比图）。
结果可视化与交付
目标：以直观、美观且可溯源的方式呈现分析成果，方便科研复现与成果产出。
常见图型：
● UMAP / t-SNE（细胞群分布）
● 火山图（差异基因显著性）
● 气泡图（marker表达模式）
● 热图（基因表达矩阵、聚类特征）
● 轨迹图（拟时序与分支结构）
● 通讯弦图 / 网络图（细胞间信号互作）
交付内容：
● 分析报告（PDF/HTML，含图文解读）
● 细胞类型注释表、聚类标签表
● 差异表达基因列表（含统计指标）
● 通路富集与功能注释结果表
● 关键图件源文件（SVG/PNG，高分辨率）
● 全流程复现脚本与参数记录（便于复现）
可选增强：
● 在线交互式浏览（Shiny App / CellxGene / Vitessce）
● 与团队知识库对接，便于后续复用
- 肿瘤研究：解析分型与耐药机制，预测免疫治疗应答
- 免疫学：追踪亚群谱系、活化或衰竭状态，评估疫苗免疫效果
- 组织发育与再生医学：揭示谱系决定与微环境调控机制
- 罕见病与自身免疫病：定位致病细胞群并解析分子特征
- 药效与毒理学：分析给药前后细胞状态变化，评估靶向性与安全性
单细胞转录组分析为科研人员提供了细胞层级的精准视角，帮助揭示生物过程中的关键机制与细胞多样性。 它不仅是基础研究的重要工具，也在临床转化、药物开发等领域展现出广阔的应用前景。